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उत्पाद विवरण:
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| उत्पाद का नाम: | क्यूपीसीआर | भंडारण तापमान: | -20 डिग्री सेल्सियस |
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| सीडीएनए संश्लेषण के लिए मजबूत और सक्रिय: | 55 डिग्री सेल्सियस तक। | आवेदन पत्र: | पीसीआर |
| मात्रा: | 1 मिली | रिवर्स प्रतिलेखन: | तापमान सीमा (42-60 डिग्री सेल्सियस) |
| हाई लाइट: | यूनिवर्सल क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स,टेम्प्लेट कमजोर बफर क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स,क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स बायोकेमिकल रिएजेंट |
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2×यूनिवर्सल ब्लू जीएसके ग्रीन क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स 40×येलो टेम्प्लेट कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ
2×यूनिवर्सल ब्लू जीएसके ग्रीन क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स का परिचय:
यह उत्पाद GSK ग्रीन I काइमेरिक फ्लोरेसेंस विधि का उपयोग करके qPCR के लिए 2x प्रीमिक्स समाधान है।मुख्य घटक, टाक डीएनए पोलीमरेज़, एक गर्मी-सक्रिय डीएनए पोलीमरेज़ है जो एंटीबॉडी विधि द्वारा अवरुद्ध है, जो कम तापमान की स्थिति के तहत गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को प्रभावी ढंग से रोक सकता है।इस बीच, qPCR के लिए अनुकूलित प्रतिक्रिया बफर के साथ संयुक्त, Taq डीएनए पोलीमरेज़ उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता qPCR प्रतिक्रिया के लिए बहुत उपयुक्त है।एक व्यापक मात्रात्मक क्षेत्र में एक अच्छा मानक वक्र प्राप्त किया जा सकता है, जो लक्ष्य जीन के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सटीक, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय है।साथ ही, इस उत्पाद में एक विशेष आरओएक्स पैसिव रेफरेंस डाई शामिल है जो सभी क्यूपीसीआर उपकरणों में उपयोग के लिए उपयुक्त है, और विभिन्न उपकरणों पर आरओएक्स एकाग्रता को समायोजित करने की कोई आवश्यकता नहीं है।प्रीमिक्स में नीली डाई डाली जाती है, जिसमें नमूने जोड़ने का ट्रेसर प्रभाव होता है, और एक ही समय में पीला टेम्पलेट मंदक प्रदान किया जाता है।जब टेम्प्लेट को पीले टेम्प्लेट मंदक से पतला किया जाता है और ब्लू रिएक्शन प्रीमिक्स में जोड़ा जाता है, तो रंग नीले से हरे रंग में बदल जाता है, जो प्रतिक्रिया प्रणाली प्रक्रिया की तैयारी में एक ट्रेसर भूमिका निभा सकता है और रिसाव या गलत जोड़ को रोक सकता है।नीले और पीले रंग के स्पेक्ट्रा qPCR रंगों के साथ ओवरलैप नहीं होते हैं और प्रतिक्रिया परिणामों को प्रभावित नहीं करते हैं।
2 × यूनिवर्सल ब्लू जीएसके ग्रीन क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स की उत्पाद जानकारी:
| प्रोडक्ट का नाम | उत्पाद की पहचान | नमूना |
| 2 × यूनिवर्सल ब्लू ग्रीन qPCR मास्टर मिक्स 40 × येलो टेम्प्लेट कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ | जीएस-एमबीपी0044-01 | 1 मिली |
| जीएस-एमबीपी0044-05 | 5×1 एमएल | |
| जीएस-एमबीपी0044-15 | 15×1 एमएल |
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2×यूनिवर्सल ब्लू ग्रीन qPCR मास्टर मिक्स के साथ 40×येलो टेम्प्लेट कमजोर पड़ने वाले बफर के साथ भंडारण और हैंडलिंग की स्थिति:
गीला बर्फ बैग परिवहन;-20 ℃ तापमान पर संग्रहीत, 12 महीने के लिए वैध।
परख प्रोटोकॉल / प्रक्रियाएं:
1. (वैकल्पिक) 2 × यूनिवर्सल ब्लू जीएसके ग्रीन क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स का टेम्प्लेट कमजोर पड़ना:
यह किट एक 40x पीला टेम्पलेट कमजोर पड़ने वाला बफर प्रदान करता है, एक 40-गुना पतला पीला टेम्पलेट कमजोर पड़ने का उपयोग किया जा सकता है जिसका उपयोग सटीक रूप से यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि तरल के रंग को बदलकर टेम्पलेट को qPCR प्रतिक्रिया द्रव में जोड़ा गया है या नहीं।20ul qPCR प्रतिक्रिया प्रणाली को एक उदाहरण के रूप में लेते हुए, 20ul qPCR प्रतिक्रिया समाधान में जोड़े गए कमजोर पड़ने वाले टेम्पलेट राशि के अनुसार, मूल टेम्पलेट की संबंधित कमजोर पड़ने की विधि को निम्न तालिका में संदर्भित किया जा सकता है (उदाहरण के रूप में 100ul तक पतला मूल टेम्पलेट लेना) ):
| 20ul qPCR प्रतिक्रिया समाधान (उल) में पतला टेम्पलेट जोड़ें | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| 100ul टेम्पलेट कमजोर पड़ने प्रणाली (उल) के लिए 40x पीला टेम्पलेट कमजोर पड़ने बफर जोड़ें | 50 | 25 | 16.7 | 12.5 | 10 | 8.4 | 7.2 | 6.3 |
| प्राथमिक टेम्पलेट (उल) में 100ul टेम्पलेट कमजोर पड़ने की प्रणाली जोड़ें | एक्स | एक्स | एक्स | एक्स | एक्स | एक्स | एक्स | एक्स |
| Nuclease जोड़ने की मात्रा - मुक्त पानी (उल) | 50-x | 75-x | 83.3-एक्स | 87.5-x | 90-एक्स | 91.6-x | 92.8-x | 93.7-एक्स |
उदाहरण:
2ul पतला टेम्पलेट 20ul qPCR प्रतिक्रिया प्रणाली में जोड़ा जाना चाहिए।
एक उदाहरण के रूप में 100ul टेम्पलेट कमजोर पड़ने प्रणाली को लेते हुए, जब मूल टेम्पलेट मात्रा 20ul है, 25ul 40x पीला टेम्पलेट प्रदूषण बफर जोड़ा जाता है, और फिर Nuclease मुक्त पानी 55ul 100ul की कुल मात्रा में जोड़ा जाता है।
40x येलो टेम्प्लेट डाइल्यूशन बफर अब 10x है।पतला टेम्पलेट के 2ul को 20ul कमजोर पड़ने वाले बफर में जोड़ें, और अंतिम 40 × पीला टेम्पलेट कमजोर पड़ने वाला बफर 1x है।अंत में, अंतिम qPCR सिस्टम में येलो टेम्प्लेट कमजोर पड़ने वाला बफर 1x होना चाहिए।
टिप्पणी:यदि टेम्प्लेट को पतला करने की आवश्यकता नहीं है, या यदि G3362-2 के टेम्प्लेट मंदक का उपयोग नहीं किया जाता है, तो आप इस चरण को अनदेखा कर सकते हैं।
2. 2 × यूनिवर्सल ब्लू जीएसके ग्रीन क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स के बारे में क्यूपीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली की सिफारिश करें ::
| अवयव | 20ul rxn | 50ul rxn | अंतिम एकाग्रता |
| 2×यूनिवर्सल ब्लू SYBR ग्रीन qPCR मास्टर मिक्स | 10ul | 25ul | 1× |
| फॉरवर्ड प्राइमर (10uM)a | 0.4ul | 1ul | 0.2uM |
| रिवर्स प्राइमर (10uM)a | 0.4ul | 1ul | 0.2uM |
| खाकाब | चर | चर | जैसी ज़रूरत |
| न्यूक्लीज मुक्त पानी | 20ul . में जोड़ें | 50ul . में जोड़ें |
एक।आमतौर पर, 0.2um की अंतिम एकाग्रता के साथ एक अच्छा प्रवर्धन प्रभाव प्राप्त किया जा सकता है।जब प्रतिक्रिया प्रदर्शन खराब होता है, तो प्राइमर एकाग्रता को 0.2-1.0um की सीमा में समायोजित किया जा सकता है।
बी।टेम्पलेट जोड़ की मात्रा टेम्पलेट समाधान में लक्ष्य जीन की प्रतिलिपि संख्या के साथ भिन्न होती है, और टेम्पलेट जोड़ की उचित मात्रा पर ग्रेडिएंट कमजोर पड़ने पर चर्चा की जाती है।20ul प्रतिक्रिया प्रणाली में टेम्पलेट डीएनए की सबसे अच्छी अतिरिक्त मात्रा 100 एनजी से कम थी।जब आरटी-पीसीआर प्रतिक्रिया के सीडीएनए (आरटी प्रतिक्रिया समाधान) को टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया गया था, तो अतिरिक्त राशि पीसीआर प्रतिक्रिया समाधान की कुल मात्रा के 10% से अधिक नहीं होनी चाहिए।
3. पीसीआर प्रतिक्रिया प्रक्रिया (उपकरणों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है):
ए: यदि प्रवर्धन विशिष्टता में सुधार की आवश्यकता है, तो दो-चरणीय प्रक्रिया या एनीलिंग तापमान का उपयोग किया जा सकता है;प्रवर्धन दक्षता में सुधार के लिए, तीन-चरणीय प्रक्रिया या विस्तार समय का उपयोग किया जा सकता है।
टिप्पणी:
1. RNase संदूषण से बचने के लिए कृपया ऑपरेशन के दौरान डिस्पोजेबल दस्ताने पहनें।
2. रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन उत्पादों को थोड़े समय के लिए -20 ℃ पर संग्रहीत किया जा सकता है।यदि लंबे समय तक भंडारण की आवश्यकता होती है, तो बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचने के लिए पैकिंग के बाद उन्हें -80 ℃ पर स्टोर करने की सिफारिश की जाती है।
3. यदि टेम्प्लेट यूकेरियोटिक मूल का है, तो ओलिगो (डीटी) 18 प्राइमर का चयन करने और इसे यूकेरियोटिक एमआरएनए की 3 'पॉली ए पूंछ के साथ जोड़ने की सिफारिश की जाती है ताकि पूर्ण लंबाई वाले सीडीएनए की उच्चतम उपज प्राप्त हो सके।
4. प्रोकैरियोटिक आरएनए के रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के लिए रैंडम हेक्सामर प्राइमर या जीन स्पेसिफिक प्राइमर का इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
5. रैंडम हेक्सामर प्राइमर की व्यापक प्रयोज्यता है और यह mRNA, rRNA, tRNA, छोटे RNA और lncRNA टेम्प्लेट के लिए उपयुक्त है।
6. यदि रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन के बाद qPCR परख होती है, तो Oligo (dT)18 प्राइमर और रैंडम हेक्सामर प्राइमर को mRNA के सभी क्षेत्रों में सीडीएनए संश्लेषण दक्षता को समान बनाने के लिए मिलाया जा सकता है, जो मात्रात्मक परिणामों की प्रामाणिकता और दोहराव में सुधार करने में मदद करता है।
7. यदि बाद के qPCR प्राइमरों को एक्सॉन में डिज़ाइन किया गया है, तो जीनोम हटाने के चरण को छोड़ा जा सकता है।
प्राइमर डिजाइन सिद्धांत:
1. प्रवर्धन उत्पाद की लंबाई 80-300 बीपी के बीच होने की सिफारिश की जाती है;
2. प्राइमर लंबाई: 18-25 बीपी;
3. प्राइमरों में बेस जी+सी की सामग्री 40%-60% के बीच होनी चाहिए;
4. फॉरवर्ड प्राइमर और रिवर्स प्राइमर के बीच टीएम वैल्यू अंतर 2 ℃ से कम है, और 58-62 ℃ के बीच टीएम वैल्यू सबसे अच्छा है;
5. आधार वितरण की यादृच्छिकता;
6. प्राइमरों में स्व-पूरक अनुक्रम शामिल नहीं थे, अन्यथा वे एक माध्यमिक हेयरपिन संरचना बनाएंगे;
7. दो प्राइमरों के बीच 4 से अधिक पूरक या समजातीय आधार नहीं होने चाहिए, अन्यथा प्राइमर डिमर बन जाएगा, विशेष रूप से 3' छोर पर पूरक ओवरलैप;
8. प्राइमर का 3' टर्मिनल बेस G या C होने का सुझाव दिया गया है;
9. एनसीबीआई तुलना परिणामों में कोई अन्य गैर-विशिष्ट उत्पाद नहीं मिला।
सामान्य समस्याएं और समाधान:
| समस्या का विवरण | संभावित कारण | समाधान |
| प्रतिक्रिया के अंत में, कोई प्रवर्धन वक्र दिखाई नहीं दिया या CT मान बहुत देर से दिखाई दिया | टेम्पलेट एकाग्रता बहुत कम है | टेम्पलेट कमजोर पड़ने वाले गुणकों को कम करने के लिए प्रयोग को दोहराएं, और नमूना एकाग्रता अज्ञात होने पर उच्चतम एकाग्रता से शुरू करें |
| टेम्पलेट गिरावट | खाका फिर से तैयार किया गया और प्रयोग दोहराया गया | |
| सिस्टम में पीसीआर इनहिबिटर होते हैं | आम तौर पर, टेम्प्लेट को अंदर ले जाया जाता है, टेम्प्लेट के कमजोर पड़ने वाले अनुपात को बढ़ाया जाता है या उच्च शुद्धता वाले टेम्प्लेट को फिर से तैयार किया जाता है और दोहराया जाता है | |
| प्राइमर ख़राब हो सकते हैं | जिन प्राइमरों का लंबे समय से उपयोग नहीं किया गया है, उन्हें पहले पृष्ठ वैद्युतकणसंचलन द्वारा अखंडता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए ताकि गिरावट की संभावना से इंकार किया जा सके। | |
| कम प्रवर्धन दक्षता | प्राइमर एकाग्रता बढ़ाएँ, तीन-चरणीय प्रवर्धन प्रक्रिया आज़माएँ, या प्राइमर को फिर से डिज़ाइन करें | |
| प्रवर्धन उत्पाद बहुत लंबा है | प्रवर्धन उत्पाद की लंबाई 80-300 बीपी . की सीमा में नियंत्रित की गई थी | |
| रिक्त नियंत्रण संकेत दिखाता है | प्रतिक्रिया प्रणाली प्रदूषण | सबसे पहले, खाली नियंत्रण पानी को बदला जाना चाहिए।यदि फिर भी यही स्थिति बनी रहती है, तो प्राइमर, एस्पिरेटर और पीसीआर ट्यूब को बदल दिया जाना चाहिए या एक नया मास्टर मिक्स शुरू किया जाना चाहिए।एयरोसोल प्रदूषण को कम करने के लिए एक सुपर क्लीन टेबल में प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार की जाती है |
| प्राइमर डिमर जैसे गैर-विशिष्ट प्रवर्धन दिखाई देते हैं |
आम तौर पर, 35 चक्रों के बाद प्रवर्धन उत्पादों का रिक्त नियंत्रण में प्रकट होना सामान्य है, जिसका विश्लेषण गलनांक वक्र के साथ किया जाना चाहिए। प्राइमर को फिर से डिज़ाइन करें, प्राइमर एकाग्रता को समायोजित करें या पीसीआर प्रतिक्रिया प्रक्रिया को अनुकूलित करें |
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| पिघलने की अवस्था में कई चोटियाँ होती हैं | प्राइमर डिजाइन खराब है | प्राइमर डिजाइन सिद्धांतों के अनुसार नए प्राइमर को फिर से डिजाइन किया गया था |
| प्राइमर एकाग्रता बहुत अधिक है | प्राइमर एकाग्रता को उचित रूप से कम करें | |
| सीडीएनए टेम्पलेट में जीनोमिक संदूषण है | निकाले गए आरएनए समाधान को जीनोमिक संदूषण को दूर करने के लिए, या ट्रांसिनट्रॉन प्राइमरों को डिजाइन करने के लिए डीएनए एंजाइम, जैसे डीएसडीएनएएस का उपयोग करके पचाया जाता है। | |
| प्रयोगों की खराब प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता | नमूना जोड़ने की त्रुटि बड़ी है |
सटीक पिपेट का उपयोग, उच्च गुणवत्ता वाले चूषण सिर सटीक पिपेट के साथ; उच्च तनुकरण टेम्पलेट, नमूना त्रुटि को कम करने के लिए बड़ी मात्रा में टेम्पलेट जोड़ना; QPCR की प्रतिक्रिया मात्रा बढ़ाई गई थी |
| टेम्पलेट एकाग्रता बहुत कम है | टेम्पलेट के कमजोर पड़ने के समय को कम करने के लिए प्रयोग को दोहराएं | |
| क्यूपीसीआर उपकरण के विभिन्न स्थानों पर तापमान विचलन | क्यूपीसीआर उपकरण को नियमित रूप से कैलिब्रेट करें | |
| प्रवर्धन वक्र चिकना नहीं है | प्रतिदीप्ति संकेत बहुत कमजोर है, सिस्टम सुधार के बाद उत्पन्न होता है |
सुनिश्चित करें कि मास्टर मिक्स में पहले से मिश्रित रंग खराब नहीं होते हैं; बेहतर qPCR उपभोग्य सामग्रियों को इकट्ठा करने के लिए फ्लोरोसेंट सिग्नल को बदलें |
| प्रवर्धन वक्र टूट जाता है या फिसल जाता है | टेम्प्लेट की सघनता अधिक थी और बेसलाइन समापन बिंदु मान CT मान से अधिक था | बेसलाइन एंडपॉइंट (सीटी मान -3) कम किया गया था और डेटा का पुन: विश्लेषण किया गया था |
| व्यक्तिगत कुओं का प्रवर्धन वक्र अचानक तेजी से गिरा | प्रतिक्रिया ट्यूब में बुलबुले होते हैं |
सुनिश्चित करें कि मिक्स पूरी तरह से भंग हो गया है, और समान रूप से घूमें और दोलन न करें; नमूना जोड़ने के बाद, बुलबुले को हल्के लोचदार के साथ सेंट्रीफ्यूजेशन द्वारा हटा दिया जाता है। बुलबुले को हटाने के लिए पूर्व-विकृतीकरण का समय 10 मिनट तक बढ़ा दिया गया था |
अगर आपको 2×यूनिवर्सल ब्लू जीएसके ग्रीन क्यूपीसीआर मास्टर मिक्स विद 40×येलो टेम्प्लेट डाइल्यूशन बफर के बारे में अधिक जानकारी चाहिए, तो कृपया हमें ऑनलाइन बताएं, धन्यवाद।
व्यक्ति से संपर्क करें: Ms Kris
दूरभाष: +8613049739311
